Nou mètode per detectar virus d’ARN com el SARS-CoV-2
Experts de la Universitat de Barcelona, l’Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC), l’Institut de Microelectrònica de Barcelona (IMB-CNM-CSIC) i l’Institut de Nanociència i Materials de l’Aragó (INMA) —un institut mixt del CSIC i la Universitat de Saragossa (UNIZAR)— han desenvolupat un mètode per detectar ARN virals que es basa en la tecnologia d’ús de sondes formadores d’estructures tríplex. Aquesta innovadora metodologia obre noves opcions per detectar virus com ara el SARS-CoV-2, el virus de la grip A (H1N1) o el virus sincicial respiratori (VSR), un patogen que afecta nounats i que exigeix un atent diagnòstic diferencial.
Aquest treball interdisciplinari, publicat a la revista International Journal of Molecular Sciences, el lideren Carlos J. Ciudad i Verónica Noé, de la Facultat de Farmàcia i Ciències de l’Alimentació i l’Institut de Nanociència i Nanotecnologia (IN2UB) de la UB; Ramón Eritja, Anna Aviñó, Lluïsa Vilaplana i M. Pilar Marco, de l’IQAC-CSIC i el CIBER de Bioenginyeria, Biomaterials i Nanomedicina (CIBER-BBN); Manuel Gutiérrez, Antoni Baldi i César Fernández, de l’IMB-CNM-CSIC, i Valeria Grazu i Jesús Martínez, investigadors del CSIC a l’INMA (CSIC-UNIZAR) i del CIBER-BBN.
Aquest treball de recerca es va dur a terme en el marc del projecte POC4CoV, liderat per M. Pilar Marco i César Fernández i finançat a través de Salud Global, una plataforma temàtica interdisciplinària del CSIC. Posteriorment, la recerca ha continuat com a part d’un projecte finançat per La Marató de TV3 de 2020 per lluitar contra la COVID-19, en què també participen experts de la Facultat de Química de la UB.
Pinces de polipurines per capturar l’ARN viral
La nova metodologia es basa en la capacitat de les pinces de polipurines (PPRH) —dissenyades pel Grup de Teràpia en Càncer de la UB— per capturar l’ARN viral i formar un tríplex d’alta afinitat. Quan aquesta estructura híbrida es connecta amb una sonda molecular i es posa en contacte amb la mostra del pacient afectat, s’obté un senyal de detecció de l’agent viral. El mètode presentat ara en la publicació científica s’ha denominat Triplex Enhanced Nucleic Acid Detection Assay (TENADA).
«Les PPRH són forquetes d’ADN d’una sola cadena no modificat que estan formades per dos dominis especulars de polipurines antiparal·leles. Aquests dominis, connectats entre ells per un bucle de timidina, s’uneixen per enllaços intramoleculars de Hoogsteen inversos. Les pinces moleculars poden unir-se de forma específica a seqüències de polipirimidines en virus d’ADN monocatenari (ssADN), bicatenari (dsADN) o ARN mitjançant enllaços de Watson-Crick, i formen així un tríplex antiparal·lel», detalla el catedràtic Carlos J. Ciudad, del Departament de Bioquímica i Fisiologia de la UB.
Una metodologia efectiva i més ràpida que la prova PCR
Entre els avantatges que presenta en la detecció d’ARN víric, cal destacar que la metodologia de les PPRH es pot aplicar sense la intervenció de la transcriptasa inversa —l’enzim que converteix l’ARN en ADN— ni del termociclador —l’aparell que amplifica les mostres de material genètic amb la reacció en cadena de la polimerasa (PCR)—. A més, té una sensibilitat i especificitat equivalent a la de la prova PCR i pot aportar resultats en menys d’una hora.
En el marc del treball, l’equip va utilitzar el format d’hibridació sandvitx en diversos dispositius de biodetecció. Aquesta estratègia utilitza dos oligonucleòtids: una forqueta de PPRH formadora de tríplex que actua com una sonda de captura i un oligonucleòtid d’ADN formador de dúplex marcat que actua com una sonda de detecció.
«Les forquetes de PPRH que formen tríplex es van dissenyar per unir-se a seqüències de polipirimidina del SARS-CoV-2, mentre que les sondes de detecció es van dissenyar com a complementàries d’una regió propera al lloc de la diana de les polipirimidines. Així, la presència de l’ARN del SARS-CoV-2 es detecta mitjançant la formació del complex ternari en la superfície del biosensor», detalla la catedràtica Verónica Noé (UB-IN2UB).
Aquesta metodologia s’ha implementat en un dispositiu electroquímic compacte que integra una cel·la electroquímica de dos elèctrodes en un xip —fabricada a la Sala Blanca de Micro i Nanofabricació de l’IMB-CNM-CSIC—, i en un component fluídic en paper, i en un sistema de flux lateral tèrmic implementat en nitrocel·lulosa i utilitzant nanopartícules plasmòniques i paper tèrmic, i desenvolupat a l’INMA (CSIC-UNIZAR).
TENADA: aplicacions en recerca biomèdica
En la bibliografia científica, les PPRH es descriuen com eines de silenciament gènic de diversos gens implicats principalment en el càncer. A més, s’han incorporat com a sondes en biosensors per a la detecció de petites molècules d’ARN (miRNA) per determinar l’estat de metilació de l’ADN i per al diagnòstic de pneumònia causada pel fong Pneumocystis jirovecii.
Ara, la nova metodologia TENADA es revela eficaç no només en la detecció de partícules virals: l’alta afinitat dels PPRH per l’ARN viral és una propietat que es pot aplicar per inhibir el procés de replicació del virus. Per això, ara també són objecte d’estudi les propietats antivirals de les pinces de polipurines CC1PPRH i CC2PPRH en cèl·lules del llinatge Vero E6 infectades amb virions de SARS-CoV-2.
En paral·lel, el treball dels diferents grups implicats també ha estat la base d’una tecnologia que es va patentar i llicenciar al juliol de 2022 mitjançant la participació del Centre de Patents de la UB, el CSIC i el CIBER-BBN. Alhora, aquesta patent s’ha llicenciat de manera no exclusiva a l’empresa espanyola Nanoimmunotech a través de la gestió de la Fundació Bosch i Gimpera (FBG-UB) en el procés de protecció de la tecnologia i l’acord de llicència de l’empresa.